Asosiy kontent

Yuqori sinf biologiyasi

Course: Yuqori sinf biologiyasi > Unit 6

Lesson 3: Biotexnologiya

DNKni tartiblash

Google sinfxona

DNKning bir qismida nukleotid asoslarining (A, T, S va G) ketma-ketligi qanday aniqlanishi.

Asosiy tushunchalar:

DNK sekvenirlash – DNK boʻlagidagi nukleotidlar (A, T, S va G) ketma-ketligini aniqlash jarayoni.
Sanger boʻyicha sekvenirlashda nishon DNKdan koʻplab nusxalar olinib, turli uzunlikdagi fragmentlar hosil qilinadi. Fluoressent “terminator zanjir” nukleotidlari fragment oxiriga birikadi va ularni aniqlashga imkon beradi.
Yangi avlod sekvenirlash usuli yangi, keng yondashuvli, yuqori tezlikka ega va kamxarajat talab usuli hisoblanadi.

Sekvenirlash nima?

Genom ketma-ketligi toʻgʻrisida eshitgan boʻlsangiz kerak. Misol uchun, koʻp yillik harakatlar natijasida inson genomi 2003-yilda toʻliq oʻrganildi. Lekin genom yoki DNK kichik bir fragmentining ketma-ketligi nimani anglatadi?

DNK sekvenirlash – DNK boʻlagi tarkibidagi asoslar (A, T, S va G) ketma-ketligini aniqlash jarayoni. Bugungi kunda kerakli uskunalar va anjomlar yordamida DNKning kichik boʻlagini sekvenirlash nisbatan oson.

Butun genom (organizmdagi barcha DNK)ni sekvenirlash hamon murakkab vazifa boʻlib qolmoqda. Bu jarayon genom DNKsini koʻplab kichik boʻlaklarga boʻlish, boʻlaklarni sekvenirlash va bitta uzun zanjirga yigʻishni talab qiladi. Biroq soʻnggi yigirma yil ichida ishlab chiqilgan yangi usullar tufayli hozir genomni sekvenirlash “Inson genomi loyihasi”ga qaraganda ancha tezroq va arzonroqstart superscript, 1, end superscript.

Bu maqolada DNK sekvenirlash usulini yaqindan koʻrib chiqamiz. Hozirgi kunda yaxshi yoʻlga qoʻyilgan Sanger boʻyicha sekvenirlash usuliga toʻxtalamiz, shu bilan birga, yuqori tezlik va arzon narxga ega boʻlgan yangi (“keyingi avlod”) usul haqida ham gaplashamiz.

Sanger boʻyicha sekvenirlash: zanjir terminatsiyasi usuli

DNKning 900 asos juftiga ega boʻlgan qismi asosan Sanger boʻyicha sekvenirlash yoki zanjir terminatsiya deb nomlanuvchi usullar yordamida sekvenirlanadi. Sanger boʻyicha sekvenirlash 1977-yilda britaniyalik olim Fred Sanger tomonidan kashf qilingan.

Inson genomi loyihasida Sanger boʻyicha sekvenirlash inson DNKsining nisbatan kichik fragmentlari ketma-ketligini aniqlash uchun ishlatiladi. (Ushbu fragmentlar 900 aj dan kam boʻlmasligi kerak edi, lekin tadqiqotchilar koʻp marotaba Sanger usulini qoʻllash yordamida har bir fragmentni oʻrganish imkoniga ega boʻldi.) Fragmentlar DNKning kattaroq qismlari va butun xromosomaga birlashish uchun ketma-ket tizilib, bir-birining ustiga joylashadi.

Garchi hozir genom tezkor va arzon usullar yordamida sekvenirlanayotgan boʻlsa ham, Sanger boʻyicha sekvenirlash DNKni klonlash yoki polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) orqali hosil qilingan DNKning alohida fragmentlarini sekvenirlash uchun qoʻllanadi.

Sanger boʻyicha sekvenirlashda ishlatiladigan ingrediyentlar

Sanger boʻyicha sekvenirlashda DNK nishon qismining nusxasi koʻp marotaba olinadi. Buning uchun kerakli ingrediyentlar inson organizmidagi DNK replikatsiyasi yoki DNKni in vitro koʻpaytiruvchi polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) uchun kerak boʻladigan ingrediyentlar bilan oʻxshash. Bular quyidagilar:

DNK polimeraza fermenti
Praymer. DNKning bir zanjirli kichik qismi boʻlib, andoza DNKga bogʻlanadi va polimeraza uchun “boshlab beruvchi” vazifasini bajaradi.
Toʻrtta DNK nukleotidlari (dATF, dTTF, dSTF, dGTF)
Ketma-ketligi aniqlanishi kerak boʻlgan andoza DNK

Lekin Sanger boʻyicha sekvenirlash reaksiyasi uchun oʻziga xos (yagona) ingrediyent ham kerak boʻladi:

Dideoksi yoki zanjir terminatsiyalovchisi – har biri har xil rangli boʻyoq bilan boʻyalib nishonlangan toʻrtta nukleotid (ddATF, ddTTF, ddSTF, ddGTF)

Dideoksi nukleotidlar doimiy yoki deoksi nukleotidlarga oʻxshash, lekin bitta farqi – uglevod halqasidagi 3’ uglerodda gidroksil guruhning yoʻqligi. Doimiy nukleotidda 3’ gidroksil guruh mavjud zanjirga yangi nukleotidlarni biriktirish uchun “ilgich” vazifasini bajaradi.

Zanjirga dideoksi nukleotidi birikkach, boʻsh gidroksil guruhi qolmaydi va yangi nukleotidlar birikmaydi. Zanjir dideoksi nukleotid bilan tugaydi, asos turiga qarab (A, T, S yoki G) boʻyoqning maʼlum bir rangi bilan boʻyaladi.

[Boʻyoq qayerga biriktiriladi?]

Sanger boʻyicha sekvenirlash usuli

Sekvenirlanishi kerak boʻlgan DNK namunasi probirkada praymer, DNK polimeraza va nukleotidlar (dATF, dTTF, dGTF va dSTF) bilan aralashtiriladi. Toʻrtta boʻyalib nishonlangan zanjir terminatsiyalovchi dideoksi nukleotidlar ham qoʻshiladi, lekin oddiy nukleotidlarga qaraganda kamroq miqdorda.

Dastlab andoza DNKni denaturatsiyalash (zanjirlarini ajratish) uchun aralashma qizdiriladi, keyin esa praymer bir zanjirli andozaga bogʻlanishi uchun sovitiladi. Praymer bogʻlangach, harorat yana oshiriladi, bu DNK polimerazaga praymerdan boshlab yangi DNK zanjiri sintezlashi uchun sharoit yaratadi. DNK polimeraza zanjirga nukleotid biriktirishni boshlaydi, bu holat normal nukleotid oʻrniga dideoksi nukleotidni zanjirga biriktirguncha davom etadi. Shu nuqtada boshqa nukleotidlar qoʻshilmaydi, shuning uchun zanjir dideoksi nukleotid bilan tugaydi.

Bu jarayon bir nechta sikl davom etadi. Sikl tugagandan soʻng kamida bitta reaksiya davomida nishon DNKning har biriga dideoksi nukleotidi qoʻshilishi deyarli kafolatlanadi. Reaksiya oxirida, probirkada har birining tarkibida boshlangʻich DNKdagi nukleotidlarga ega boʻlgan turli uzunlikdagi fragmentlar boʻladi (quyidagi rasmga qarang). Fragmentlarning oxirgi uchlari soʻnggi nukleotidni koʻrsatuvchi boʻyoqlar bilan yorliqlangan.

[Barcha fragmentlar yorliqlanadimi?]

Reaksiya tugagach fragmentlar oʻzida gel saqlagan uzun va ingichka nay boʻylab harakatlana boshlaydi, bu jarayon kapillyar gel elektroforezi deb nomlanadi. Qisqa fragmentlar geldagi poralar orqali tez harakatlanadi, uzunlari esa sekinroq harakatlanadi. Har bir fragment probirka oxiridagi “finish” chizigʻini bosib oʻtgandan soʻng, boʻyoqni aniqlashga yordam beruvchi lazer nuri bilan yoritiladi.

Eng kichik fragment (praymerdan keyin bitta nukleotid bilan tugaydigan) finish chizigʻini birinchi bosib oʻtadi, ikkinchi boʻlib undan kattarogʻi (praymerdan keyin ikkita nukleotid bilan tugaydigan) bosib oʻtadi va shu tariqa davom etadi. Shunday qilib, boʻyoq ranglari birin-ketin detektor (aniqlagich)ga yozib olinadi, boshlangʻich DNK boʻlagining ketma-ketligi maʼlum vaqt ichida tiklanadi. Detektor tomonidan yozib olingan maʼlumotlar yuqoridagi xromatogrammada koʻrsatilganidek, fluoressent nurlarining yuqori nuqtaga chiqishini oʻz ichiga oladi. Xromatogrammadagi DNK ketma-ketliklari shu yuqori nuqtalar orqali oʻqiladi.

Foydalanish va cheklovlar

Sanger boʻyicha sekvenirlash nisbatan uzun (900 tagacha asos juftlariga ega boʻlgan) DNK zanjirlari ketma-ketligini aniqlashda yaxshi natija beradi. U odatda DNKning bakteriya plazmidlari yoki PZRda nusxasi olingan alohida DNK boʻlaklarini sekvenirlash uchun ishlatiladi.

Shu bilan birga, Sanger boʻyicha sekvenirlash katta hajmdagi loyihalar, masalan, butun genomni yoki metagenomni (mikroblar jamoasining “kollektiv genomini”) sekvenirlash uchun qimmat va samarasiz hisoblanadi. Bu kabi vazifalar uchun yangi, keng miqyosli sekvenirlash usullari tezkor va arzonroq.

Yangi avlod sekvenirlash

Bu nom xit boʻlgan qoʻshiq nomiga oʻxshab eshitilishi mumkin, lekin aslida ham shunday nomlanadi! Soʻnggi DNK sekvenirlash usullarining nomi umumiy qilib yangi avlod sekvenirlash deb nomlanadi.

Turli xil texnologiyalardan foydalanadigan har xil yangi avlod sekvenirlash usullari mavjud. Biroq ularni Sanger boʻyicha sekvenirlashdan ajratib turadigan bir qator xususiyatlar mavjud:

Yuqori darajadagi parallellik: koʻplab sekvenirlash reaksiyalari bir vaqtning oʻzida sodir boʻladi
Kichik oʻlchov: reaksiyalar juda kichik hajmda va hatto chiplarda amalga oshirilishi mumkin
Tezkor: reaksiyalar parallel sodir boʻlgani uchun natijalar darhol tayyor boʻladi
Arzon: genomni sekvenirlash Sanger boʻyicha sekvenirlashga nisbatan arzonga tushadi
Qisqa uzunlik: 50
$\mbox{-}$ 700 ta nukleotiddan iborat uzunlikda oʻqiladi

Umuman olganda, keyingi avlod sekvenirlash juda katta miqdordagi kichik Sanger boʻyicha sekvenirlash reaksiyalarini parallel ravishda bajarishga oʻxshaydi. Ushbu parallellik va kichik hajmi tufayli katta miqdordagi DNKni Sanger boʻyicha sekvenirlashga qaraganda yangi avlod usullari bilan tezroq va arzonroq sekvenirlash mumkin. Misol uchun, 2001-yilda inson genomini sekvenirlash narxi dollar sign, 100 start text, m, i, l, l, i, o, n, end text boʻlgan. 2015-yilda esa bor-yoʻgʻi dollar sign, 1245 ni tashkil qilgansquared!

Nega sekvenirlashning tez va arzon boʻlishi muhim? Doimiy ravishda genomlarni sekvenirlash imkoniyati biologiya tadqiqotlari va biotibbiy dasturlar uchun yangi imkoniyatlarga yoʻl ochadi. Masalan, arzon narxlardagi sekvenirlash xususiylashtirilgan tibbiyotga ilk qadam, yaʼni inson ehtiyojiga qarab uning genomidagi gen variantlari tuzilishiga asoslangan holda tibbiy davolashga imkon yaratadi.

[Qoʻshimcha maʼlumot va manbalar]

Saralash:

Muhokamaga qoʻshilmoqchimisiz?

Kirish

Hozircha izohlar yoʻq.

Ingliz tilini tushunasizmi? Khan Academyʼning inglizcha saytida boʻlayotgan muhokamalarni koʻrish uchun shu yerga bosing.