Asosiy kontent

Biologiya

Course: Biologiya > Unit 17

Lesson 3: DNK tahlil metodlari

Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR)

Google sinfxona

DNK maxsus nishon qismining koʻplab nusxalarini hosil qilish uchun qoʻllanadigan usul.

Asosiy tushunchalar:

Polimeraza zanjir reaksiyasi yoki PZR bu maʼlum DNK boʻlagini in vitro (odam organizmida emas, tajriba probirkasida) koʻp marta nusxalash usuli hisoblanadi.
PZR termostabil DNK polimerazaga, Taq polimerazaga, bogʻliq va DNKning shu qismi uchun maxsus DNK praymerlari boʻlishini talab qiladi.
PZRda harorat oʻzgarishi bilan reaksiya bir necha marta takrorlanadi, shu orqali DNK nishon qismining koʻplab nusxalarini olish mumkin.
PZR ustida koʻplab tajribalar va amaliy dasturlar olib borilgan. Bundan asosan DNKni klonlash, tibbiy diagnostika va sud-tibbiy ekspertizasida foydalaniladi.

PZR nima?

Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) bu DNK maʼlum qismining koʻplab marotaba (million yoki milliard) nusxasini olish uchun qoʻllanadigan, keng tarqalgan laborator usul hisoblanadi. Bu DNK qismi tajriba oʻtkazuvchini qiziqtirgan har qanday soha boʻlishi mumkin. Misol uchun, bu tadqiqotchi funksiyasini aniqlashni maqsad qilgan gen yoki sud-tibbiy ekspertizasida jinoyatni ochish uchun qoʻllanadigan genetik ashyoviy dalil boʻlishi ham mumkin.

Odatda PZRning maqsadi DNKning kerakli qismini tahlil qilish yoki boshqa maqsadlar uchun yetarli darajada hosil qilishdir. Misol uchun, PZR orqali koʻpaytirilgan DNK keyingi tajribalar, masalan, ketma-ketlikni aniqlash, gel elektroforez yoki klonlash uchun yuborilishi mumkin.

PZR biologiya va tibbiyotning koʻplab sohalari, xususan, molekulyar biologiya, tibbiy tashxislash va hatto ekologiyaning ayrim sohalarida ham qoʻllanadi.

Taq polimeraza

Organizm hujayrasidagi DNK replikatsiyasi kabi, PZR jarayonida ham yangi DNK zanjirlarini hosil qilish uchun andoza DNK va DNK polimerazalarning boʻlishi talab etiladi. PZRda odatda Taq polimeraza deb nomlangan DNK polimerazasi qoʻllanadi, bu issiqlikka chidamli bakteriyalardan (Thermus aquaticus) ajratib olinadi.

T. aquaticus issiq buloqlar va gidrotermal tuynuklarda yashaydi. Uning DNK polimerazasi issiqlikka juda chidamli va

70 ° C

(bu haroratda odam yoki E. coli DNK polimerazasi nofunksional holatda boʻladi) atrofida eng faol holatda boʻladi. Bu haroratga chidamli Taq polimeraza PZR uchun juda mos keladi. Koʻrib turganimizdek, PZRda yuqori harorat andoza DNKni denaturatsiyalash yoki uning zanjirlarini ajratish uchun takroriy ravishda qoʻllanadi.

PZR praymerlar

Boshqa DNK polimerazalar singari Taq polimeraza ham faqatgina qisqa nukleotidlar ketma-ketligi, yaʼni praymerlar mavjud boʻlgandagina DNK sintezini boshlashi mumkin. PZR reaksiyalarida tajriba oʻtkazuvchi praymer yordamida nusxasi olinishi yoki koʻpaytirilishi kerak boʻlgan DNK qismini belgilaydi.

PZR praymerlari qisqa bir zanjirli DNK boʻlaklari boʻlib, odatda

20

ta nukleotiddan iborat. Har bir PZR reaksiyasida ikkita praymer ishlatiladi va ular nishon (nusxalanishi kerak boʻlgan) qismga yon tomonlaridan birikishga moslashtirilgan. Bunda praymerlar ketma-ketligi andoza DNKning qarama-qarshi zanjiriga, yaʼni nusxasi yaratilishi kerak boʻlgan qismning chetki uchi (qirrasi)ga bogʻlanadi. Praymerlar andozaga komplimentar asos juftlashuvi orqali bogʻlanadi.

Praymerlar andozaga bogʻlangach, ular polimerazalar tomonidan uzaytiriladi va ularning oʻrtasida joylashgan qismning nusxasi yaratiladi.

[DNK va praymer yoʻnalganligi toʻliqroq yoritilgan rasm]

PZR bosqichlari

PZR reaksiyasining asosiy tarkibiy qismlari Taq polimeraza, praymerlar, andoza DNK va nukleotidlar (DNK qurilish birliklari)dir. Ferment uchun zarur boʻlgan kofaktorlar bilan birga yuqoridagilar bitta probirkaga yigʻiladi, keyin yuqori va past harorat almashinib turuvchi takroriy siklga qoʻyiladi, natijada DNK sintezlanadi.

Asosiy bosqichlar:

Denaturatsiya ( $96 ° C$ ‍): DNK zanjirlarini denaturatsiya qilish yoki ajratish uchun reaksiyaga yuqori harorat beriladi. Natijada keyingi bosqich uchun kerakli bir zanjirli andoza hosil boʻladi.
Yumshatish ( $55$ ‍ $-$ ‍ $65$ ‍ $° C$ ‍): praymerlar andoza DNKdagi komplimentar qismlariga bogʻlanishi uchun reaksiyada harorat pasaytiriladi.
Uzaytirish ( $72 ° C$ ‍): Taq polimeraza praymerlarni uzaytirib, yangi DNK zanjirlarini sintezlashi uchun reaksiyada harorat koʻtariladi.

Bu sikl oddiy PZR reaksiyasida

25

-

35

marta takrorlanadi, umumiy hisobda DNKning koʻpaytiriladigan qismiga bogʻliq ravishda

2

-

4

soat vaqt sarflanadi. Agar reaksiya samarali (yaxshi natijali) boʻlsa, nishon qism bir nechtadan milliard marotabagacha koʻpayishi mumkin.

Chunki har reaksiyada faqat boshlangʻich DNK andoza sifatida xizmat qilmaydi, balki bitta reaksiyada yangi sintezlangan DNK ham keyingi reaksiyada andozaga aylanadi. Reaksiyada praymerlar va Taq polimeraza molekulalari juda koʻp miqdorda boʻladi, shu tufayli DNK molekulalari soni har reaksiya siklida ikki barobarga ortishi mumkin. Bunday eksponensial oʻsish darajasi quyidagi rasmda tasvirlangan.

PZR natijalarini vizual tekshirish uchun gel elektroforezdan foydalaniladi

PZR reaksiyasi natijalari odatda gel elektroforez usuli yordamida vizual (koʻz bilan koʻriladigan) tahlil qilinadi. Gel elektroforez – bu DNK fragmentlarini elektr toki yordamida gel matritsasi orqali oʻtkazib, ularni hajmiga koʻra ajratadigan usul. Odatda PZR namunasidagi boʻlaklarning oʻlchamlarini aniqlash uchun standart yoki DNK chizgʻichlari kiritiladi.

Bir xil uzunlikka ega boʻlgan DNK fragmentlari gelda “tasma” hosil qiladi va gel DNK bogʻlovchi boʻyoq bilan boʻyalgan boʻlsa, oddiy koʻz bilan koʻrish mumkin. Misol uchun,

400

asos jufti (aj) hosil boʻladigan PZR reaksiyasi gelda quyidagicha koʻrinishda boʻladi:

DNK tasmasi DNK nishon qismining bitta yoki bir nechta nusxasini emas, balki juda koʻplab nusxasini oʻz ichiga oladi. DNK mikroskopik oʻlchamda boʻlgani sababli koʻz bilan koʻrish uchun juda koʻp nusxalar bir joyga yigʻilishi kerak. Bu PZR muhimligini koʻrsatuvchi yana bir isbot: DNK ketma-ketligi yetarlicha nusxada ishlab chiqariladi va koʻz bilan koʻrish orqali boshqariladi.

PZR dasturi

PZR orqali DNK ketma-ketligi million yoki milliard marotaba koʻpaytirilishi mumkin, hosil boʻlgan nusxalar boshqa usullar yordamida tekshiriladi. Misol uchun, DNK gel elektroforez usuli yordamida vizual tahlil qilinishi, ketma-ketlikni aniqlash uchun yuborilishi yoki restriktaza fermentlari yordamida parchalanishi va plazmidga klonlanishi mumkin.

PZR koʻplab tadqiqot laboratoriyalari va sud-tibbiy ekspertizasi, genetik tadqiqot va tashxislash kabi amaliy ishlarda qoʻllanadi. Misol uchun, PZR genetik buzilishlar bilan bogʻliq genlarni (yoki prenatal testda homila DNKsini) koʻpaytirish uchun ishlatiladi. PZR tekshiruvidan inson organizmidagi bakteriya yoki virus DNKsini aniqlashda ham foydalaniladi: agar patogen mavjud boʻlsa, qon yoki toʻqima namunasidan DNK qismlarini koʻpaytirish imkoni mavjud.

Namuna muammosi: sud tibbiyotida PZR

Faraz qiling, siz sud-tibbiy ekspertiza laboratoriyasida ishlaysiz. Qoʻlingizga uchta gumonlanuvchi shaxs DNK namunasi, shu bilan birga, jinoyat joyidan olingan soch DNK namunasi kelib tushdi. Sizning vazifangiz maʼlum bir genetik markerni tekshirish va uchta gumonlanuvchidan qaysi birining soch DNKsi ushbu markerga mos kelishini aniqlashdan iborat.

Marker ikkita allel yoki versiya koʻrinishida boʻladi. Bittasi bir marta takrorlangan qism (rasmda jigarrang bilan belgilangan), keyingisi ikki marta takrorlangan qismdan iborat. Praymerlar bilan kechadigan PZR reaksiyasida birinchi allel

200

aj

, ikkinchisi esa

300

aj

DNK fragmenti hosil qiladi:

Siz toʻrtta DNK namunasida PZR oʻtkazdingiz va quyida koʻrsatilgandek gel elektroforez yordamida natijalarni vizual tahlil qilasiz:

Bu markerga jinoyat joyidan olingan qaysi gumonlanuvchining DNK namunasi mos keladi?

[Maʼlumot]

PZR va sud-tibbiy ekspertizasi haqida toʻliqroq

Haqiqiy sud-tibbiy ekspertizalarida hodisa sodir boʻlgan joyda DNK tahlillari mutaxassislar tomonidan yuqoridagi misolda keltirilganga oʻxshash tartibda oʻtkaziladi. Shuningdek, bir qator turli xil markerlar (misoldagi kabi bitta markerda emas) voqea sodir boʻlgan joydan olingan DNK va gumon qilinuvchilarning DNKsi oʻrtasida taqqoslanishi mumkin.

Bundan tashqari, odatiy sud-tibbiy ekspertizasida ishlatiladigan markerlar faqatgina ikki xil koʻrinishda boʻlmaydi. Ular yuqori darajada polimorf (poly = koʻp, morph = shakl) boʻladi. Yaʼni ular kichik qismlari boʻyicha farq qiladigan koʻplab allellar shaklida boʻladi.

Sud-tibbiy ekspertizasida eng koʻp ishlatiladigan markerlar qisqa toʻplamli takrorlanishlar (QTT) deb nomlanadi, juda koʻp miqdordagi bir xil nukleotid ketma-ketliklaridan iborat (odatda

2

dan

5

gacha uzunlikda). QTTning bitta alleli

20

ta takrordan iborat boʻlishi, boshqalari esa

18

ta va hatto

10

ta takrordan iborat boʻlishi mumkin

^{1}

Har biri koʻplab allel shakllarda keluvchi koʻp sonli markerlarni tahlil qilgan holda sud-tibbiy ekspertizasi mutaxassislari DNK namunadan yagona boʻlgan genetik “barmoq izi” yaratadilar. Odatiy QTT tahlillarida

13

ta marker qoʻllanadi, soxta musbat natijalar chiqishi ehtimoli

10

milliard

1

taga teng

^{1}

Biz DNK dalillari faqatgina jinoyatchilarni jazoga hukm qilish uchun foydalaniladi, deb oʻylashimiz mumkin, ammo bu nohaq ayblanganlarni (shu bilan birga, yillar davomida qamoqda boʻlganlarni) oqlashda ham hal qiluvchi rol oʻynaydi. Sud-tibbiy ekspertizasi otalikni aniqlash va tabiiy ofatlar joyidan inson qoldiqlarini aniqlash uchun ham ishlatiladi.

[Qoʻshimcha maʼlumot va manbalar]

Muhokamaga qoʻshilmoqchimisiz?

Kirish

Saralash:

Hozircha izohlar yoʻq.

Ingliz tilini tushunasizmi? Khan Academyʼning inglizcha saytida boʻlayotgan muhokamalarni koʻrish uchun shu yerga bosing.