If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Agar veb-filtrlardan foydalanayotgan boʻlsangiz *.kastatic.org va *.kasandbox.org domenlariga ruxsat berilganligini tekshirib koʻring.

Asosiy kontent

Restriktaza fermentlari & DNK ligaza

Restriksion parchalash. Yopishqoq uchlar va oʻtmas uchlar. Ligatsiya reaksiyalari.

Asosiy tushunchalar:

  • Restriktaza fermentlari DNKni boʻlaklarga boʻluvchi fermentlar hisoblanadi. Har bir ferment DNKdagi bitta yoki bir nechta ketma-ketlikni taniydi va shu qism orqali DNKni boʻlaklarga boʻladi.
  • Aksariyat restriktaza fermentlari siljigan kesmalar shaklida kesadi, bir zanjirli zinapoyasimon DNK oxirlarini hosil qiladi. Lekin baʼzilari toʻmtoq uchli oxirlar hosil qiladi.
  • DNK ligaza DNKni bir-biriga ulovchi ferment hisoblanadi. Agar ikkita DNK boʻlagi bir-biriga mos oxirlarga ega boʻlsa, ligaza ularni bitta zanjir qilib ulashi mumkin.
  • DNKni klonlashda restriktaza fermentlari va DNK ligaza genlar hamda boshqa qismlarni plazmidlarga biriktirish uchun qoʻllanadi.

DNK qanday kesiladi va joylashtiriladi?

DNKni klonlashda tadqiqotchilar DNK bir boʻlagining, masalan, genning koʻplab nusxasini oladi. Koʻp hollarda klonlash genni bakteriyalarga koʻchirilishi mumkin boʻlgan plazmid deb ataluvchi DNK doirasiga kiritishni oʻz ichiga oladi.
Qanday qilib turli manbadan olingan DNK boʻlaklari (odam geni va bakterial plazmid) birikib, yagona DNK molekulasini hosil qiladi? Shunday keng tarqalgan usullardan biri restriktaza fermentlari va DNK ligazalardan foydalanishga asoslanadi.
  • Restriktaza ferment bu DNKni kesuvchi ferment boʻlib, u DNKdagi maʼlum saytlar (ketma-ketliklar)ni taniydi. Koʻplab restriktaza fermentlari oʻzi tanib oladigan saytlar yoki ularning yonida kesishni amalga oshiradi, bu esa bitta zanjirli, zinapoyasimon oxirli DNK boʻlagi hosil boʻlishi bilan tugaydi.
  • Agar ikkita DNK molekulasining oxirlari oʻzaro mos kelsa, ular DNK ligaza yordamida bir-biriga ulanadi. DNK ligaza boʻlaklari oʻrtasidagi uzilishni ulab, yagona DNK molekulasini hosil qiladi.
Restriktaza fermentlari va DNK ligazasi koʻpincha DNKni klonlash paytida genlar va boshqa DNK qismlarini plazmidlarga kiritish uchun ishlatiladi.

Restriktaza fermentlari

Restriktaza fermentlari bakteriya (va boshqa prokariotlar) hujayralarida mavjud. Ular DNKning restriktaza saytlari deb nomlangan ketma-ketliklarini taniydi va bogʻlanadi. Har bir restriktaza fermenti faqat bitta yoki bir nechta restriktaza saytlarini taniydi. Ferment nishon ketma-ketligini topganda, DNK molekulasida ikki zanjirli kesma hosil qiladi. Odatda kesish restriktaza saytida yoki uning yaqin qismida boʻladi va tartib bilan, oldindan belgilangan shaklda amalga oshiriladi.
Restriktaza fermenti DNK ketma-ketligini tanib, uni qanday kesishiga misol tariqasida laboratoriyada keng foydalaniladigan ferment – EcoRI ni koʻrib chiqamiz. EcoRI quyidagi saytlarni kesadi:
EcoRI ushbu saytni tanib, kesishni har doim aniq bir shaklda bajaradi, natijada bitta zanjirli zinapoyasimon oxirga ega DNK hosil boʻladi:
Agar DNKning boshqa bir boʻlagi mos keluvchi oxirlarga ega boʻlsa (masalan, uni ham EcoRI kesgan boʻlsa), ular komplimentar asoslar juftligi orqali bir-biriga birikib qolishi mumkin. Shu sababli bitta zinapoyasimon oxirlarni hosil qiluvchi fermentlar yopishqoq uchlarni hosil qilib kesuvchi fermentlar deyiladi. Yopishqoq uchlar klonlashda yordam beradi, chunki ular DNK ligazasi bilan bogʻlanishi uchun ikkita DNK boʻlaklarini ushlab turadi.
Restriktaza fermentlarining barchasi ham yopishqoq uchlar hosil qilmaydi. Ayrimlari “toʻmtoq uchlar” hosil qilib, nishon qismining oʻrtasidan kesadi va zinapoyasimon uch hosil qilmaydi. SmaI restriktaza fermenti toʻmtoq uch hosil qilib kesuvchi fermentga misoldir:
Toʻmtoq uchli fragmentlar oʻzaro DNK ligazalar yordamida biriktiriladi. Lekin toʻmtoq uchli fragmentlar qiyin bogʻlanadi (samarasi va natijasi yaxshi chiqish ehtimoli kam), chunki ularda DNK molekulasini ushlab turuvchi zinapoyasimon oxirlar mavjud emas.

DNK ligaza

DNK replikatsiyasi haqida oʻrgangan boʻlsangiz, demak, DNK ligaza haqida maʼlumotga ega boʻlsangiz kerak. DNK replikatsiyasida ligazaning vazifasi yangi sintezlangan DNK parchalarini birlashtirib, yagona zanjir hosil qilishdan iborat. DNKni klonlashda ishlatiladigan ligazalar ham shu kabi vazifani bajaradi. Agar ikkita DNKning bir-biriga mos keladigan uchlari boʻlsa, unda DNK ligazasi ularni birlashtirib, yaxlit molekula hosil qilishi mumkin.
DNK ligazasi buni qanday amalga oshiradi? Ligaza energiya manbai sifatida ATFdan foydalangan holda reaksiyani katalizlaydi, unda bitta DNK zanjirining 5ʼ uchiga yopishgan fosfat guruhi boshqa zanjirning uchiga yopishgan gidroksil guruhi bilan bogʻlanadi. Ushbu reaksiya yaxlit uglevod-fosfat asosni hosil qiladi.

Rekombinant plazmid olish

Kesish va ulash jarayonlari genni plazmidga kiritishda qanday ishlashini koʻrib chiqamiz. Tasavvur qiling, qoʻl ostimizda EcoRI taniydigan saytga ega boʻlgan gen va bitta EcoRI saytga ega plazmid bor:
Bizning maqsadimiz – plazmidga gen kiritish uchun EcoRI fermentidan foydalanish. Dastlab gen parchasini va plazmidni EcoRI yordamida alohida-alohida kesamiz. Ushbu bosqich yopishqoq uchlari boʻlgan boʻlaklarni hosil qiladi:
Keyin gen parchasini va chiziqli (ochilgan) plazmidni olib, ularni DNK ligazasi yordamida birlashtiramiz. Ikkala boʻlakning yopishqoq uchlari komplimentar asoslar orqali bir-biriga yopishadi:
Ligaza ularni birlashtirgandan soʻng, parchalar yaxlit DNKning bir boʻlagiga aylanadi. Natijada nishon gen plazmidga kiritilib, rekombinant plazmid hosil qilinadi.

Restriksion kesish va ulashlar koʻplab DNK molekulalarini oʻz ichiga oladi

Yuqoridagi misolda biz gen va EcoRI yordamida kesilgan plazmid oʻrtasidagi bogʻlanishning bitta natijasini koʻrdik. Ammo xuddi shu bogʻlanishda boshqa natijalar ham boʻlishi mumkin. Masalan, kesilgan plazmid genni qabul qilmasdan resirkulyar holatga kelishi (qaytadan halqa shakliga kirishi) mumkin. Xuddi shunga oʻxshab, gen plazmidga kirish oʻrniga orqaga qarab joylashishi ham mumkin (chunki uning ikkita EcoRI yopishqoq uchlari bir xil).
Bu kabi kesish va ligatsiya koʻplab plazmid va gen DNK nusxalari yordamida amalga oshiriladi. Aslida bitta ligatsiya (ulash)da milliardlab DNK molekulalari ishlatiladi! Bu molekulalarning barchasi bir-biriga va DNK ligazasiga tasodifiy ravishda turli yoʻllar bilan urilib ketadi. Shunday qilib, agar bir nechta mahsulotni tayyorlash mumkin boʻlsa, ularning barchasi maʼlum chastotada amalga oshiriladi, shu jumladan, biz istamagan mahsulotlar ham hosil boʻladi.
Qanday qilib “yomon” plazmidlar hosil boʻlishining oldini olish mumkin? DNK ligatsiyasi orqali bakteriya transformatsiya qilinganda, har biri DNKning turli boʻlagini egallaydi. Bakteriyani transformatsiyadan keyin tekshirib, faqat kerakli plazmidga ega boʻlganidan foydalanamiz. Koʻp hollarda transformatsiyalangan bakteriyadan olingan plazmid boshqa restriktaza fermentlari yordamida toʻgʻri joydan kesilgani tekshiriladi.

Khan Academyʼdan tashqari manbalarni ham kashf qiling

Restriktaza fermentlari haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi interaktiv material va ushbu simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.
DNK ligaza haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi interaktiv material va ushbu simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.
LabXchange fanlarni bepul oʻrgatuvchi platforma boʻlib, Garvard universitetining sanʼat va fan fakulteti va Amgen jamiyati tomonidan yaratilgan.