Asosiy kontent

Course: Biologiya > Unit 17

Lesson 2: DNKni klonlash

Umumiy tushuncha: DNKni klonlash

Taʼrifi, maqsadi va DNKni klonlashning asosiy bosqichlari.

Asosiy tushunchalar:

DNKni klonlash – DNK molekulasining koʻplab nusxalarini olishning molekulyar biologik usuli.
Odatiy klonlash tajribasida nishon gen plazmid deb nomlanuvchi halqasimon DNK boʻlagiga kiritiladi.
Transformatsiya jarayoni orqali plazmid bakteriya ichiga kiritiladi va antibiotiklar yordamida plazmid tutgan bakteriyalar ajratib olinadi.
Kerakli plazmidga ega bakteriyadan yanada koʻproq plazmidlar olishda yoki baʼzan genni ifodalash va oqsil hosil qilishda foydalaniladi.

Kirish

Balki siz “klonlash” degan soʻzni eshitganingizda butun boshli organizmni (masalan, Dolli laqabli qoʻy) klonlashni tasavvur qilishingiz mumkin. Ammo klonlash har qanday narsaning genetik jihatdan ayni nusxasini olish maʼnosini anglatadi. Molekulyar biologiya laboratoriyalarida asosan gen yoki kichik DNK boʻlagi klonlanadi.

Agar molekulyar biolog doʻstingiz “klonlash” oʻxshamadi desa, u boshqa yana bir Dollini klonlashni emas, balki DNKning bir qismini klonlashni nazarda tutgan boʻladi!

DNKni klonlash toʻgʻrisida umumiy maʼlumot

DNKni klonlash muayyan bir DNK boʻlagining mutlaq oʻxshash va bir nechta nusxalarini olish jarayonidir. Odatiy DNKni klonlash jarayonida dastlab bitta gen yoki DNKning biror kerakli fragmenti (tibbiy jihatdan muhim hisoblangan inson geni boʻlishi mumkin) halqasimon DNK boʻlagi – plazmidga kiritiladi. DNKni plazmidga kiritish jarayoni DNKni “kesuvchi” va “ulovchi” fermentlardan foydalanilgan holda amalga oshiriladi. Hosil boʻlgan plazmidning yangi DNKsi rekombinant DNK deb yuritiladi.

Keyin rekombinant plazmid bakteriyalar ichiga yuboriladi. Oʻzida plazmid saqlovchi bakteriyalar ajratib olinadi va oʻstiriladi. Bakteriyalar boʻlinib koʻpaygan vaqtda plazmidlar ham replikatsiyalanadi, yangi paydo boʻlgan bakteriyalarga oʻtadi.

Plazmidda DNK ketma-ketligining koʻplab nusxalarini yaratishning ahamiyati nimada? Baʼzi hollarda tajriba oʻtkazish yoki yangi plazmidlar olish uchun bizga juda koʻp DNK boʻlaklari kerak boʻladi. Boshqa hollarda esa DNK boʻlagi kerakli oqsilni kodlaydi. Biz plazmidli bakteriyalardan oqsil “fabrikasi” sifatida foydalanamiz. Masalan, odam insulin geni oʻtkazilgan E. coli bakteriyasi diabet bilan ogʻrigan bemorlar uchun insulin ishlab chiqaradi.

Agar doʻstlaringiz yoki qarindoshlaringiz orasida qandli diabet bilan kasallangan kishilar boʻlsa, demak, insulin gormoni inson salomatligida muhim rol oʻynashini yaxshi bilsangiz kerak. Sogʻlom insonda oshqozon osti bezida insulin ishlab chiqariladi va qonga ajratiladi. Insulin qon orqali butun tanadagi hujayralarga tarqalib, glyukozaning hujayralar tomonidan oʻzlashtirilishini taʼminlab beradi.

Birinchi tur qandli diabet bilan kasallangan odamning insulin ishlab chiqaruvchi oshqozon osti bezi hujayralari shikastlangan yoki nobud boʻlgan boʻladi. Birinchi tur qandli diabet bilan kasallangan bemorlar doimiy insulin qabul qilib turishlari kerak. Insulin qondagi yuqori glyukoza miqdorini normallashtiradi (hujayraga energiya vazifasini bajaruvchi glyukoza oʻtishini taʼminlaydi).

Uzoq yillar mobaynida, goʻshti uchun soʻyilgan choʻchqa va qoramollarning oshqozon osti bezlaridan 1-tur qandli diabetda foydalaniladigan insulin olingan. Odam, choʻchqa va qoramolning insulin molekulasi juda oʻxshash. Shuning uchun bu hayvonlarning insulini 1-tur qandli diabet kasalligida odam insulinining oʻrnini bosa oladi.

Olimlar 1980-yillardan boshlab Escherichia coli (E. coli) bakteriyasidan insulin olish usulini rivojlantirdi. Bir soʻz bilan aytganda, olimlar bakteriyani insulin ishlab chiqaruvchi fabrikaga aylantirishdi. Hozir ushbu usulda olingan rekombinant – turli organizmlardan (inson va bakteriyalar) olingan DNK kombinatsiyasi orqali hosil qilingan insulin 1-tur qandli diabetning asosiy davosi hisoblanadi.

DNKni klonlash bosqichlari

DNKni klonlash juda koʻp maqsadlarda qoʻllanadi. Hozir oqsil (odam insulini) sintezi uchun DNKni klonlashdan qanday foydalanilishini koʻrib chiqamiz. Asosiy bosqichlar quyida keltirilgan:

Plazmidni kesamiz va kerakli genni ulaymiz. Bu jarayon restriktaza (DNKni kesuvchi) va DNK ligaza (ulovchi) fermentlari ishtirokida amalga oshiriladi.
Bakteriya hujayrasiga plazmidni kiritamiz. Plazmidli bakteriyalarni antibiotik orqali saralab olamiz.
Oʻzida plazmid saqlovchi bakteriyalarni oʻstiramiz (koʻpaytiramiz) va ulardan oqsil ishlab chiqaruvchi “fabrika” sifatida foydalanamiz. Bakteriyadan oqsilni ajratib olamiz va uni tozalaymiz.

Endi har bir bosqichga chuqurroq toʻxtalib oʻtamiz.

1. DNKni kesish va ulash

Turli manbalardan olingan DNK boʻlaklarini qanday birlashtiramiz? Keng qoʻllanadigan usulda ikki turdagi fermentdan foydalaniladi: restriktaza va DNK ligaza.

Restriktaza DNK kesuvchi ferment boʻlib, DNKdagi muayyan nukleotidlar ketma-ketligini taniydi va DNKni oʻsha nuqtada yoki unga yaqinroq joydan ikkiga boʻladi. Restriktaza fermentlarining aksariyati kalta va bir zanjirli kesiklarni hosil qiladi. Agar ikkita DNK molekulasining nukleotid ketma-ketligi komplementar boʻlsa, bir-biriga yopishadi. Ammo ular birikib, butun DNK molekulasini hosil qila olmaydi. Faqat DNK ligaza fermentigina DNK asosidagi tirqishlarni biriktira oladi.

Bizning klonlashdan maqsadimiz moʻljallangan genni plazmidga kiritish hisoblanadi. Restriktaza fermentini eʼtibor bilan tanlab, quyidagilarni kesamiz.

Yagona kesiluvchi nuqtasi boʻlgan plazmid
Kesilgan uchlari bor tanlangan gen fragmenti

Keyin DNK fragmentlarini ligaza fermenti orqali ulaymiz. Natijada tanlangan genga ega boʻlgan rekombinant plazmid olamiz.

2. Bakterial transformatsiya va tanlash

Plazmid va boshqa DNK molekulalarini bakteriya hujayrasiga (odatda laboratoriyalarda xavfsiz E. coli bakteriyasidan foydalaniladi) kiritiladi. Bu jarayon transformatsiya deb yuritiladi. Transformatsiya jarayoni davomida yuqori temperatura taʼsirida boʻlgan bakteriyalar begona DNK molekulasini qabul qiladi.

Odatda plazmidda antibiotikka chidamli gen boʻlib, plazmid transformatsiya boʻlgan bakteriyani antibiotik taʼsiridan saqlaydi. Plazmidni qabul qilgan bakteriya antibiotik qoʻshilgan ozuqa muhitida yashay oladi va koʻpayadi. Plazmidsiz bakteriyalar esa antibiotik taʼsirida halok boʻladi. Har bitta yashab qolgan bakteriya kichkina nuqta koʻrinishidagi guruh – koloniyalarni hosil qiladi. Har bitta koloniyani tashkil etgan bakteriyalarda bir turdagi plazmidlar boʻladi.

Barcha koloniyalarda ham biz xohlagan kerakli plazmidlar boʻlmaydi. Chunki DNK fragmentlarini ulash vaqtida barcha fragmentlar biz istagandek ulanmaydi. Bir nechta koloniyalarni tekshirib, qaysi koloniyada biz xohlagan plazmid borligini aniqlab olamiz. Plazmidlarni tekshirishda kesish va ulash va PZR metodlaridan keng foydalaniladi.

3. Oqsil sintezlash

Oʻzimiz xohlagan plazmidga ega boʻlgan bakteriya koloniyasini topganimizdan soʻng, oʻsha koloniyani oʻstira olamiz. Keyin kimyoviy signal orqali bakteriyaga oqsil ishlab chiqarish haqidagi koʻrsatmani yetkazamiz.

Bakteriyalar oqsil ishlab chiqaruvchi kichkina fabrikalarga aylanadi. Agar plazmidimiz tarkibida inson insulinini kodlovchi gen boʻlsa, bakteriya oʻsha gendan foydalanib koʻp miqdorda insulin oqsilini hosil qiladi.

Odamlarda ham, bakteriyalarda ham genetik kod bir xil. Bu odam genlari bakteriya hujayrasida transkripsiyalanishi va translyatsiya qilinishi mumkinligini anglatadi.

Lekin bakteriya hujayrasida odam geni ekspressiyalanishi uchun oʻsha genda bitta muhim modifikatsiya qilish zarur. Aniqrogʻi, oʻsha genda intronlar boʻlmasligi kerak. Intronlar odamdagi koʻplab genlar ichida uchraydi va ular eukariot RNK molekulasi tarkibidan ajratib olinadi. Intronlarni RNKdan ajratib olish splaysing deb yuritiladi. Bakteriyalarning oʻzida intronlar yoʻq va ular RNK transkripsiyalarini splaysing qila olmaydi.

Qanday qilib odam genidagi intronlardan xalos boʻlamiz? Odam genining intronlarsiz variantini iRNK molekulasidan qaytar transkriptaza fermenti yordamida sintezlaymiz. Qaytar transkriptaza iRNK zanjiridan andoza sifatida foydalanib, DNK zanjirini sintezlaydi. Shundan soʻng, intronlarsiz qoʻsh zanjirli DNK molekulasi (cDNK – komplementar DNK) hosil boʻladi.

Oqsil sintezlab boʻlingandan soʻng bakteriya hujayrasidan oqsilni ajratib olish mumkin boʻladi. Bakteriya hujayrasida bizga kerakli boʻlgan oqsildan tashqari juda koʻp boshqa oqsil va makromolekulalar bor. Shuning uchun kerakli oqsil boshqa oqsillardan ajratib olinishi va tozalanishi kerak. Oqsilni tozalashda biokimyoviy usullardan foydalaniladi. Tozalangan oqsildan tajriba maqsadida yoki insulin kabi dorilar sifatida foydalanish mumkin.

Ha va yoʻq. Farmatsevtika kompaniyalari rekombinant insulinni ichida inson geni bor bakteriyalar orqali oladi. Bakteriyalardan olingan insulin ustunli tozalash usuli orqali tozalanadi.

Lekin biologik faol insulinni ishlab chiqarish baʼzi qoʻshimcha bosqichlarni ham talab qiladi. Insulin oddiy polipeptid zanjiri koʻrinishida sintezlanadi. Ammo zanjir ichida disulfid bogʻlari boʻlishi va insulin ikkita alohida zanjirdan (zanjirlarni faqatgina disulfid bogʻlari bogʻlab turadi) iborat boʻlishi kerak. Shundan keyingina insulin bemor organizmidagidek biologik faol gormon vazifasini bajara oladi.

Qandli diabet bilan ogʻrigan bemorlar uchun insulin ishlab chiqarish yuqoridagi qoʻshimcha bosqichlarni talab qiladi va bu bosqichlar oqsilni tozalash jarayoni bilan birga olib boriladi. Shunda insulin oqsili oʻzining haqiqiy uch oʻlchamli shaklini oladi.

DNKni klonlash usullaridan foydalanish

Klonlash usullari orqali olingan DNK molekulalari molekulyar biologiyada turli maqsadlarda foydalaniladi. Ularga qisqa misollar keltiramiz:

Biologik dori vositalari. DNKni klonlashdan tibbiy-biologik usullar orqali odam oqsilini (yuqorida koʻrilgan insulin kabi) olish mumkin. Oʻsish gormoni va plazminogen aktivatori toʻqimasi (tPA) ham rekombinant oqsillarga misol boʻladi. Oʻsish gormonini sintezlay olmaydigan bemorlarga oʻsish gormoni berilsa, plazminogen aktivator toʻqimasi insult (miyaga qon quyilishi)ni davolashda va tromblar hosil boʻlishining oldini olishda qoʻllanadi. Yuqoridagi kabi rekombinant oqsillar koʻpincha bakteriyalar orqali olinadi.
Gen terapiyasi. Baʼzi genetik nuqsonli bemorlarda biror-bir gen funksiyasi yetishmaydi. Gen terapiyasida shunday bemorlarning hujayralariga oʻsha genning normal shaklini koʻchirishga harakat qilinadi. Masalan, DNKni klonlash orqali mukovitsidoz bilan kasallangan bemorga nuqsonli genning normal shaklini saqlagan plazmid koʻchiriladi. Shunda plazmid koʻchirilgan bemorning oʻpka funksiyasining yomonlashishi sekinlashadi.
Gen tahlili. Odatiy tadqiqot laboratoriyalarida biologlar DNKni klonlashdan genlarning sunʼiy rekombinant variantlarini olishda foydalanishadi. Olingan genlar organizmda normal genlar qanday ishlashini tushunishga yordam beradi.
Masalan, pashshaning neyronlarini oʻrganayotgan tadqiqotchilar DNKni klonlashdan neyron geni uchun reportyor qurilma yigʻishda foydalanishadi. Bu qurilmadagi genni boshqaruvchi soha (promotor) fluoresent oqsil sintezlovchi genning oldiga joylashtirilishi mumkin. Qurilma pashshaga koʻchirilganda “reportyor gen” neyronlar geni bilan birga bir xil neyron hujayralarida boʻladi. Natijada oʻsha neyronlar ultrabinafsha nurlari ostida yorugʻ nur tarqatadi.

Bular hozirgi kunda biologiyada DNKni klonlash qay maqsadlarda ishlatilishining bir nechta misollari, xolos. DNKni klonlash molekulyar biologiyaning turli sohalarida juda keng foydalaniladigan usul hisoblanadi.

Khan Academyʼdan tashqari manbalarni ham kashf qiling

Restriktaza fermentlari haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi interaktiv material va ushbu simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.

DNK ligaza va gen klonlanishi haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi interaktiv material va ushbu simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.

Bakteriya transformatsiyasi haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.

Transformatsiya boʻlgan bakteriya seleksiyasi haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.

LabXchange fanlarni bepul oʻrgatuvchi platforma boʻlib, Garvard universitetining sanʼat va fan fakulteti va Amgen jamiyati tomonidan yaratilgan.

This article is licensed under a CC BY-NC-SA 4.0 license.

Mavzuda keltirilgan iqtiboslar:

Superbest. (2014, June 11). How does heat shock transformation work? In Biology stack exchange. Retrieved from http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Qoʻshimcha maʼlumotlar:

Affibody. (n.d.). Insulin capture from human serum. Retrieved from http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Student guide. Retrieved from https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Biotechnology. (2016, March 23). Retrieved March 29, 2016 from Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology.

Gebel, E. (2013). Making insulin: A behind-the-scenes look at producing a lifesaving medication. In Diabetes forecast. Retrieved from http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.

Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (2015, July 3). In NHS choices. Retrieved from http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

R&D Systems. (2016). Recombinant human growth hormone (GH) protein. In Growth hormone. Retrieved from https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Retrieved from http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Muhokamaga qoʻshilmoqchimisiz?

Kirish

Saralash:

Hozircha izohlar yoʻq.

Ingliz tilini tushunasizmi? Khan Academyʼning inglizcha saytida boʻlayotgan muhokamalarni koʻrish uchun shu yerga bosing.