If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Agar veb-filtrlardan foydalanayotgan boʻlsangiz *.kastatic.org va *.kasandbox.org domenlariga ruxsat berilganligini tekshirib koʻring.

Asosiy kontent

Biologiya

Course: Biologiya > Unit 17

Lesson 2: DNKni klonlash
Tabiiy fanlar
Biologiya
Biotexnologiya
DNKni klonlash
© 2023 Khan AcademyFoydalanish shartlariMaxfiylik siyosatiCookie Notice

Bakterial transformatsiya & seleksiya

Google sinfxona
DNK plazmidini bakteriya hujayrasiga kiritish. Bakteriyalar qanday ajratib olinishi. Oqsil hosil qilish va tozalash.

Asosiy tushunchalar:

  • Bakteriya hujayrasi transformatsiya davomida oʻzi uchun yot boʻlgan DNKni oʻzlashtiradi.
  • Transformatsiya DNKni klonlashda eng asosiy jarayon hisoblanadi. Bu jarayon restriksion parchalash va ligatsiyadan keyin yuz beradi va yangi hosil boʻlgan plazmid bakteriyaga koʻchirib oʻtkaziladi.
  • Transformatsiyadan keyin bakteriyalar antibiotik likopchalarida seleksiya qilinadi. Plazmidga ega boʻlgan bakteriya antibiotikka rezistent hisoblanadi va koloniya hosil qiladi.
  • Kerakli plazmidga ega boʻlgan koloniyalar bir xil bakteriya kulturasini olish uchun oʻstiriladi va undan plazmid olish yoki oqsil sintezida foydalaniladi.

Katta jarayon: DNKni klonlash

Transformatsiya va seleksiya DNKni klonlashda muhim bosqich hisoblanadi. DNKni klonlash bu DNKning maxsus qismidan, masalan, gendan koʻplab nusxalar olish jarayonidir. Nusxa olish jarayoni koʻpincha bakteriyada amalga oshiriladi.
Oddiy klonlash tajribasida tadqiqotchilar dastlab DNKning bir qismini, genni, halqasimon tuzilishga ega boʻlgan plazmidga kiritishadi. Bu bosqichda restriktaza fermentlari va DNK ligazadan foydalaniladi va bu jarayon ligatsiya deb nomlanadi.
Ligatsiyadan keyingi bosqich DNKni bakteriyaga koʻchirib oʻtkazish, yaʼni transformatsiyadir. Keyinchalik antibiotik seleksiya va DNK analiz metodlari biz qidirayotgan plazmid tutgan bakteriyalarni aniqlashga yordam beradi.

Bakteriya transformatsiyasi va seleksiya bosqichlari

Quyida transformatsiya va bakteriya seleksiyasi uchun amalga oshiriladigan tipik ishlar ketma-ketligi keltirilgan:
  1. Maxsus tayyorlangan bakteriya (masalan, ligatsiyadan keyingi) DNK bilan aralashtiriladi.
  2. Bakteriyalarga issiqlik taʼsir ettiriladi, bu esa ayrim bakteriya hujayralari plazmidni oʻzlashtirishiga “imkon beradi”. Aksariyat bakteriyalar plazmidni oʻzlashtirmaydi.
  3. Plazmidlar antibiotikka rezistentlik genini klonlashda ishlatiladi. Shunday qilib, plazmidni biriktirgan bakteriyalarni aniqlash uchun ular antibiotik likopchasiga joylashtiriladi.
  4. Plazmidga ega boʻlmagan bakteriyalar halok boʻladi. Har bir plazmid tutgan bakteriya koloniya, yaʼni bir xil bakteriyalar toʻplamini hosil qiladi. Har bir koloniya tugmacha shaklidagi oqish nuqtadan iborat boʻladi.
  5. Bir nechta koloniyalarning kerakli plazmid saqlaganligi tekshiriladi.
  6. Kerakli plazmid saqlagan koloniya alohida idishlarda oʻstiriladi va plazmid yoki oqsil ishlab chiqarishda foydalaniladi.
  1. Maxsus tayyorlangan bakteriya (masalan, ligatsiyadan keyingi) DNK bilan aralashtiriladi.
  2. Bakteriyalarga issiqlik taʼsir ettirish, buning natijasida ayrim bakteriya hujayralari plazmidni oʻziga biriktirib oladi.
  3. Plazmidlar antibiotikka rezistentlik genini klonlashda ishlatiladi. Shunday qilib, plazmidni biriktirgan bakteriyalarni aniqlash uchun ular antibiotik likopchasiga joylashtiriladi.
Plazmid tasvirlangan rasm. Plazmid antibiotikka rezistentlik geni, bekteriyada gen ekspressiyasini boshqaruvchi promoter va ligatsiya davomida biriktirilgan nishon genni oʻz ichiga oladi.
  1. Plazmidni oʻziga biriktirmagan bakteriyalar halok boʻladi. Har bir plazmid tutgan bakteriyadan koloniya, yaʼni plazmid tutgan bir xil bakteriyalar toʻplami hosil boʻladi.
  2. Bir qancha koloniyalarning kerakli plazmid tutganligi tekshiriladi (masalan, PZR yoki restriksion parchalash orqali).
  3. Kerakli plazmid saqlagan koloniya alohida idishlarda oʻstiriladi va plazmid yoki oqsil ishlab chiqarishda foydalaniladi.

Nega koloniyalar tekshiriladi?

Koloniya hosil qiluvchi bakteriyalar oʻzida (antibiotikka rezistentlikni taʼminlovchi) plazmid tutishi kerak. Lekin hamma koloniyalar ham bir xil plazmid tutishi shart emas.
Bu qanday sodir boʻladi? DNKni ajratib olib, bakteriyaga kiritilganda koʻpincha asosiy plazmiddan tashqari qoʻshimcha mahsulotlar ham hosil boʻlishi mumkin. Misol uchun, maxsus restriktaza fermentlari yordamida gen plazmid tarkibiga kiritilish jarayonida plazmid (genni qabul qilmasdan) yopilib qolishi yoki gen teskari yoʻnalishda joylashishi mumkin.
Chap tomonda: gen plazmid tarkibiga joylashtirilgan (promoter ketma-ketligi yoʻnalishi boʻyicha). Bu aynan ligatsiya uchun olingan plazmid.
Oʻrta: plazmid genni qabul qilmasdan yopilib qolgan. Bu plazmid foydali emas.
Oʻng: gen plazmidga teskari yoʻnalishda (promoter ketma-ketligiga teskari) joylashadi. Bu plazmid gen ekspressiyasi uchun foydali hisoblanmaydi.
Plazmid teskari yoʻnalishda joylashishining nima ahamiyati bor? Ayrim hollarda buning ahamiyati yoʻq. Lekin bakteriyada gen ekspressiyasi orqali oqsil sintez qilish lozim boʻlgan hollarda gen promoter yoki gen ekspressiyasini boshqaruvchi ketma-ketlikka nisbatan toʻgʻri yoʻnalishda joylashishi kerak. Agar gen teskari joylashsa, notoʻgʻri DNK zanjiri transkripsiyalanadi va oqsil ishlab chiqarilmaydi.
Yuqoridagi hodisalarni inobatga olgan holda, koʻpaytirilishi lozim boʻlgan plazmid bor-yoʻqligini aniqlash uchun har bir koloniyani tekshirish muhim hisoblanadi. Restriksion parchalash, PZR va DNK ketma-ketliklarini aniqlash usullaridan bakteriya koloniyasidan olingan DNK plazmidni tekshirishda keng foydalaniladi.

Bakteriyada oqsil sintezi

Deylik, “kerakli” plazmidga ega boʻlgan koloniyani aniqladik. Keyin nima boʻladi? Transformatsiya, seleksiya va tahlil qilishning mohiyati nimada?

Birinchi ehtimol: bakteriyalar = plazmid korxonalari

Ayrim hollarda, bakteriyalardan koʻp miqdorda DNK palzmid ishlab chiqarish uchun “plazmid korxonalari” sifatida foydalaniladi. Plazmid DNK keyinchalik DNK klonlashda (masalan, murakkabroq plazmid hosil qilish uchun) yoki turli tajribalarda ishlatiladi.
Ayrim hollarda plazmidlar bevosita amaliy maqsadlarda ishlatiladi. Masalan, plazmidlar gen terapiyasida mukovitsidoz genetik kasalligini davolashda inson genini oʻpka toʻqimasiga kiritish uchun foydalaniladi1.

Ikkinchi ehtimol: bakteriya = oqsil korxonasi

Boshqa holatlarda bakteriyalardan oqsil korxonasi sifatida foydalaniladi. Agar plazmid kerakli nazorat ketma-ketligini oʻz ichiga olsa, kimyoviy signal qoʻshilganda, bakteriya gen ekspressiyasini qoʻzgʻatadi. Gen ekspressiyasi iRNK, undan esa oqsil hosil boʻlishiga olib keladi. Keyinchalik bakteriya oqsilni ajratib olish uchun lizisga uchratilishi (yorilishi) mumkin.
Tanlangan koloniya katta muhitda oʻstiriladi. Katta muhitda oʻstirilayotgan bakteriyalarda gen ekspressiyasini qoʻzgʻatish uchun kimyoviy signal beriladi. Har bir bakteriya hujayrasidagi gen iRNK hosil qiladi, u esa oʻz navbatida oqsil hosil qiladi. Nishon gen tomonidan kodlanadigan oqsil bakteriya ichida toʻplanadi.
Bakteriya oʻz ichiga juda koʻplab oqsil va makromolekulalarni oladi. Shu sababli yangi sintezlangan oqsillar ishlatilishdan oldin tozalanishi (boshqa oqsil va makromolekulalardan ajratilishi) kerak. Oqsillarni tozalashning har xil usullari mavjud.
Oqsil ishlab chiqargan hujayralar yoriladi (lizisga uchraydi), oqsil va boshqa tarkibiy moddalarni ajratadi. Ajralgan molekulalar nishon oqsil uchun spetsifik boʻlgan antitana mavjud ustunlarga borib yopishadi. Shunday qilib, oqsillar ustunlarda ushlab qolinadi, bakteriyadan ajralgan boshqa moddalar esa oʻtib ketadi. Soʻnggi bosqichda, ortiqcha oqsillar yuvib tashlangach, nishon oqsillar ustundagi antitanalardan ajratiladi va tozalangan oqsil sifatida foydalaniladi.
Affin xromatografiyasi deb nomlangan usulda, parchalangan bakteriyadan ajralgan molekulalar ustun orqali yoki mayda shisha boʻlaklari bilan toʻldirilgan xalta orqali oʻtkaziladi. Immun sistema oqsillari boʻlgan antitanalar bilan qoplangan ustunlar nishon molekulalarni bogʻlab oladi.
Ustundagi antitanalar oqsil aralashmasi ichidan aynan bizga kerakli boʻlgan oqsilni bogʻlaydi. Shunday qilib, bizga kerakli oqsil ustunda ushlab qolinadi, boshqa molekulalar yuvilib ketadi. Soʻnggi bosqichda kerakli oqsil ustunda ajratiladi va foydalanish uchun yigʻiladi.

Khan Academyʼdan tashqari manbalarni ham kashf qiling

Bakteriya transformatsiyasi haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.
Transformatsiya boʻlgan bakteriya seleksiyasi haqida koʻproq bilib olishni xohlaysizmi? Quyidagi simulyatsiya havolasi bilan tanishib chiqing. Manba: LabXchange.
LabXchange fanlarni bepul oʻrgatuvchi platforma boʻlib, Garvard universitetining sanʼat va fan fakulteti va Amgen jamiyati tomonidan yaratilgan.

Muhokamaga qoʻshilmoqchimisiz?

Kirish
Hozircha izohlar yoʻq.
Ingliz tilini tushunasizmi? Khan Academyʼning inglizcha saytida boʻlayotgan muhokamalarni koʻrish uchun shu yerga bosing.